「分子生物学実験：塩基配列情報の解析とデータベースの利用」

担当：安居佑季子（生命科学研究科　統合生命科学専攻　遺伝子特性学分野）

開講期間：2023 年 10 月 1 日（月）〜 　3 限目～５限目

1.9.1 データベースを利用した塩基配列の解析

遺伝情報は、DNAの塩基（G, A, T, C）配列にコードされていることから、DNAの正確な一次構造（塩基配列）を知ることは、遺伝子の機能や調節を研究する上で重要である。DNAシークエン サーから得られた塩基配列データには、不正確な部分や間違った部分があるので、正確に読めている部分のみを抽出もしくは利用する必要がある。DNA断片の 塩基配列を決定するためには、研究（補助）者が正しい配列かどうかを判定（解読）する必要がある。DNA塩基配列の決定は、現在、Sanger法を改変し た以下の手順で行われることが多い。

ここでは、（１）例題（unknown-1）に ついて解析の練習を行い，次に（２）実際に自分たちがクローン化した断片の配列について解析する。（２）の解析では、配布される波形データと塩基配列デー タを用いる。波形データはプリントで、配列データはこのページの最後に掲載されているので、各自のプリントにあるデータの番号と対応する配列を選んで解析 に用いる。実習終了時には，解析結果を各自のディスク領域に保存し，最終的にレポートにまとめること。

まず、例題（unknown-1）について説明するので、その説明に従って得られた結果を見て、以下の問いに対する答えをレポートで提出する。なお、今回配布する塩基配列データは、大腸菌DNAをクローニングベクターpBluescript SK+にクローン化したものから得られたものである。

下記の配列「unknown-1」は、FASTA形式で記載した塩基配列である。１行目の「>unknown-1」の「>」の記号は、この行がコメント行であることを示し、次の行からの配列が「unknown-1」という名称の配列であることを示す。また、この次の「>」の記号が出てくるまでは、改行やスペースがあっても、ひと続きの配列と見なされる。

>Unknown-1
NNNNNNNNANNNCCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACT
AGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTCGCACGGTTTTGCCAGCATTCAGACGCTCAA
GCACACGGTTTTCAAAGGCCTGGGTTTGTTCCATTGTTGCCTGCATATCTGACAATCTGTTATTCGGGCG
CAGGGTGTCCTGCGCCTGGTCCACCATTATTGCATTGCTTTATAAGCGGTTACCGCCTCGGATACAACCT
CGCTGTTGGCATCAAGACCGGAAATCTGTGCCAGCGCCGCCTGCGGACCTTTGTCAGCGATCAGTGCTGC
CAGTTCCTGAGCCTGCGGATCATCTTCACTGCGGAAGTGCATTGCAGCGGCAATACCTTCAATCAGGTTT
TTATGTGGCAGACCATATTCCAGCGTACCGAGCAGTGGCTTGATCAGACGGTCGCCAGCACTCAGTTTAC
GCAGTGGCTGACGGCCTACGCGCTCTACATCATCTTTCAGATACGGGTTCTCAAAACGGCCGAGAATTTT
CTGGATGTACGCCGCATGCTTGTCAGCGTCAAAGCCGTAGCGCTTGATCAATACTGCACCACTTTCTTCC
ATCGCACCTTTTACCACCGCGCGGATTTTCTCGTCGAGAATCGCGTCACGAATGGTCTGATGACCGGCCA
GTTTTCCGAGGTACGCGGTTATAGCATGACCCGTGTTCAGGGTGAAGAGTTTACGTTCGACAAATGNCAT
CAGGTTGTCGGTTAACTCCATGCCTGGGATGTTCGGCAGTGCGCCTTTGAACTGCGTTTTATCGACAATC
CATTCGCTGAANGTTTCTACCGTCACTTNCAGCGGATCGTTAGTTGCCGAAGCCCGAANGNGGTACGATG
CGGTCAACGGCGGGAATCGACAAAGCCAACGTGTTCTTCTACCCACGCTTTGGCGNCCTTCCNGGCAGGG
CGTTCATCACATGNNNTTCAGCTGNNNNNNNCCGCGTACNATGTTTNNCCNGGNNATGATGTNCAGCGGG
ATNNNTNCCTTGNTCTTNNNTTNNCNNNNNNNNNNNANNGCGNNNNNNNNNNNNNNNANNGNNNAANNGN
GNANNGNNNTAANNNANCNCNNNNNNNN

注）2行目中央にHindIII認識部位（AAGCTT）がある。この配列から以降はインサートDNA由来である。配列の終わりに近 づくと未決定塩基（確定できない塩基：Ｎで表示）が頻繁にあらわれ、不正確な配列が含まれていることが分かる。場合によっては、波形データと照合しても塩基を確定できないこともある。

1.　DNA塩基配列データの処理

（１）前処理

（２）ベクター配列の除去

クローニングベクターpBluescript SK+の説明（廃番となったため後継のpBluescript IIの説明）は、下記アドレスにある。

https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300267

配列は以下のアドレスから入手可能

https://www.addgene.org/vector-database/1951/

配布された塩基配列データ（Accession number: X52328）は、pBluescript SK+（またはpBS SK+）の一部から始まり、クローン化に用いた制限酵素の認識部位が現れる。それ以降はクローン化したDNA断片の塩基配列である。ベクターとクローン化したDNA断片の配列を区別する必要があるので、まず、HindIII 制限酵素認識部位（制限サイト）を、実際に目で探してみる。次に、この検索を下記のWWWブラウザ上のプログラムを利用して行う。

　　http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

配布された塩基配列データのベクター配列が、公開されているベクター配列と一致しているかどうかをまず確認する。次に、クローニングに用いられた制限酵素認識部位を見い出す。挿入断片の配列情報は、このクローニングサイトから数百塩基である

2. データベースを利用した塩基配列の相同性検索

　ある配列が、データベースに登録されている配列と相同性をもつかどうかは、相同性検索プログラムを用いて調べることができる。最も一般的に用いられる検索アルゴリズムはBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)とFASTAの２種である。BLASTは局所的に高い類似性を有するものを高速に検索するときに使う。FASTAはW. Pearsonによって開発されたプログラムで、はじめに文字のよく一致する領域を高速に検索し、最終的にはギャップを入れた完全なアライメントを行なう 方式をとる。FASTAは、低い全体的相同性を検出できるという特性を持っているため、長い範囲で配列の類似性を保っているものを検索するときに使われる。今回はBLASTを用いて未知配列の相同性検索を行い、その由来を明らかにする。いくつかのウェブサイトでBLAST検索用のページが公開されてい る。まず、次のサイトを見て、説明を読むこと。

　今回は、下記の３種類のサイトから１つを選んで、BLASTプログラムを利用する。説明は下記のウェブサイトにあるので各自読むこと。

使用プログラムは、まず「blastn」(nucleotide blast)を使用する。検索結果を、新規テキスト文書として名前を付けて保存する。次に、使用プログラムを「blastx」に変更して検索する。結果をblastnの場合と同様に保存する。

注）「blastn」、「blastx」のどちらを用いるかで検索に用いるデータベース（塩基配列 or アミノ酸配列？）が異なる。また、生物種などで区分したサブデータベースもいくつかあるが、今回は「nr (non-redundant)」や「全DNA／アミノ酸」といった包括的なものを選択すること。

4.　自分がクローン化した配列はどこから由来したのか？

　前述のBLAST検索サイトで得られた結果の中で、相同性を示した相手の配列の”accession | locus”の部分をクリックすれば，その配列に関する詳しい情報（生物種、遺伝子名、研究者、文献等）が得られる。また、スコアをクリックすると，２本 の配列を比較した図（アラインメント）が表示される。アラインメントの中で，相同性を示した相手の配列（Subject）の初めと終わりの塩基番号をノー トに控えておき，その塩基番号を頼りに登録済みのデータ内での相同領域の位置を推定することができる。　

配列解析アプリケーション

　EMBOSSアプリケーションを使うと、塩基配列の翻訳、制限酵素認識部位検索、相補鎖変換ツール、分子質量推定（それぞれ”transeq”、”remap”、”revseq”, “pepstat” ）をはじめ、様々な塩基配列、アミノ酸配列の解析を行うことができる。

＜補足学習＞　遺伝子工学に利用されるプラスミド等の基本的情報の取得

　本実習では、P1-B1系の規制に則り，大腸菌宿主ベクター系を用いて遺伝子のクローン化を行います。この際に利用するベクタープラスミドの性質や塩基配列情報を理解しておくことが重要です。

＜準備＞
今回使用するクローニングベクター「pBluescript SK+」（pBS-SK+と省略する）は，旧Stratagene（ス トラタジーン）社が開発し，アジレント・テクノロジー社が「In vitro RNA 転写/高解像度制限酵素サイトマップの作成」用に販売していたプラスミドです。PhageとPlasmidの両方の性質を持つので，Phagemidと メーカーでは記載しています。その第二世代のpBluescript II SK+については、アジレント社のホームページから詳しい 説明書が入手可能です。ただし，pBluescript SK+とは構造が少し異なるので注意して下さい。また，pBS−SK＋の全塩基配列はNCBI/DDBJ/EMBLデータベースにAccession 番号X52325で登録されていますから，検索して配列を取得して下さい。

＜課題１＞
SK+プラスミドDNA上に は，抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子＝βラクタマーゼ遺伝子），ラクトース分解酵素遺伝子の一部（αフラグメントをコードする遺伝 子：lacZ’），大腸菌での複製に必要な複製開始点２種類（ColE1系Ori=pUC系Oriと，f1ファージOri），マルチクローニングサイト （Multi Cloning Site, KpnI-***-HindIII-***-BamHI-***-SacI），があります。タンパク質をコードする遺伝子については，その翻訳開始コド ン，終止コドンの位置を答えなさい。また，それぞれについて説明しなさい。

＜課題２＞
ラクトースオペロンの発現制御，α相補（αコンプリメンテーション）を理解しておく必要があります。宿主として用いる大腸菌DH5αの遺 伝子型は，F－ φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK －,mK ＋) phoA supE44 λ－ thi -1 gyrA96 relA1　です。α相補に必要な性質はどの遺伝子型に依存しているのか説明しなさい。

＜課題３＞
実験で使用するGFP遺伝子断片は，制限酵素BamHIで切断されたDNAです。テキストの解説を読み，その正確なサイズが何ベースペア （bp）であるか，答えなさい。制限酵素に関しては，タカラバイオのURLから，「制限酵素の使用に際して」，「制限酵素の活性の定義，純度検定，保存，添付バッファーについて」， 「Universal Bufferによる制限酵素活性表示システム」の３ヶ所は良く読んでおきましょう。（配布するカタログにも記載されています）。

＜課題４＞
T4 DNAリガーゼは，２段階の反応を触媒してDNA同士を連結する酵素ですが，反応効率を上げるために通常のバッファー（終濃度として，66mM Tris-HCl pH7.6, 6.6mMMgCl2, 10mM DTT, 0.1mM ATP）に，次の薬品を添加します。終濃度として，10% PEG 6000ならびに200 mM NaClとなるように添加します。何故，このような添加をすると反応効率が上昇するのか説明しなさい。なお，下記の論文「Hayashi et al. Nucleic Acids Res. 13(9):3261-3271 (1985)」で詳しく検討されているので，参考にして下さ い。また，T4 DNAリガーゼが，大腸菌DNAリガーゼと違う点について説明しなさい。配布するカタログなどに説明があります。

＜課題５＞
配布されるGFP遺伝子断片が，ある方向でSK+と連結されると，融合タンパク質が大腸菌で発現されますが，そのアミノ酸配列を答えなさい。

（補足）大腸菌DH10Bの遺伝子型：F－ mcrA Δ(mrr-hsd RMS-mcr BC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ－ rpsL nupG

6.　文献情報の利用

• 配列に直接関連した文献ならば、まず、NCBIの文献データベースで、著者、キーワード、アクセション番号について検索する。
• 生物学全般についての文献は、まず、京大農学部図書室のホームページにアクセスし、「WebSPIRS」を利用すると良い（ログインの方法は講義で解説）。

また、下記のオンラインジャーナルが利用できる。

（その他参考になるURL）

（参考書籍）

＜予備配列＞

>26_1.seq
NNNNNNNANNNNNNCCTTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATC
CCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTTTGCTATCCTTGCGCCCCGATTAAACGGATAAGAGTCATTATGCAATCC
TGGTATTTACTGTACTGCAAGCGCGGGCAACTTCAACGTGCCCAGGAACACCTCGAAAGACAGGCTGTGAATTGCCTGGC
ACCGATGATCACCCTGGAAAAAATCGTGCGTGGAAAACGTACTGCAGTCAGTGAGCCATTGTTCCCCAACTACCTGTTTG
TGGAATTTGACCCAGAAGTGATTCATACCACGACTATCAACGCGACCCGCGGTGTCAGCCACTTCGTGCGCTTTGGCGCG
TCGCCAGCGATAGTCCCATCGGCGGTTATTCATCAGCTATCGGTATATAAACCGAAAGACATTGTCGATCCGGCAACCCC
TTATCCGGGTGATAAGGTGATTATTACCGAAGGCGCGTTCGAAGGCTTTCAGGCCATTTTCACCGAACCCGATGGTGAGG
CTCGCTCCATGCTATTGCTTAATCTTATTAATAAAGAGATTAAGCACAGTGTGAAGAATACCGAGTTCCGCAAACTCTAA
AACGCAATCCCAAACAGTGTTTTGACATTAGCATCCGTGGTGGCAGCCAGCCATGCGGCATCTTCTCCACGCCAGTGCGC
AATACGTTGCAAAATATGGGGCAGATGGGCTGGCTCGTTGCGCCGGGATGATGGCTTTGGCGTGAGATCGCGAGGGAGCA
GATACGGCGCATCAGTTTCGATCAGTAATTTTTCCGCCGGAATCAACGGCAAAAGTTCCCGCAGCTCCAGTCCGCGTCGT
TCATCGCAAACCCAANCCGGTAATGCCGATATAAATTNCCATGCGCCACGCACGCCTGCATCTCNTCNCGTGNGCNGGTA
AAGCANNNNNNNNANCAGGCANTTATNCANCNCNGCTCNNNNATGNCATAAANNNTCNNGGNNTCNCGNCAGNGCATNAN
TNCNGGCANNTTNAANNNTGNCNGGNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNCNNNNNNNTCNNNGNNNNNNAANNNN

>26_2.seq
NNNNNNNNNNNNNNCNCNTCACTNNNGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGAT
CCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTTATGACGCCACCATTAACCACTATCCACCAACCGAAAGATGAACTGGG
GGAGCTGGCGATTGATGTACTCATCCATCGGATAACCCAGCCGACCCTTCAGCAACAACGATTACAACTTACTCCGATTC
TGATGGAACGCGGTTCGGCTTAGATTTACGCTGTCTTTTGATCAAATTATTACCATCGGTTGTTTTCAGAAGCATGAACA
TTGCTGCTGAAGCAACAGTAATAATGCCCATTGTGATAAACGTATAGTGGAATTGTTCGACAGTCGTTGTGCCTTCCATT
CCTTCATAAACGCGAAGGACGGCCGCACTTACAGCAACGCCTAAACTAATCGACAGTTGCTGCGTGACCGCCAGAACACT
GTTACCGCTGCTGGCATTGTCATCGGTCAGATCGGCAAGTGTGATGGTATTCATCGCGGTAAACTGCGTCGACATAGCCA
TCCCTAATATAAACAACGGCAAGATCAGCATCCATATAGCCATTGCTGGTGATTGCAAAGAGAACTGAGCGATCATTAGC
CCAATAATCACCGTGATCCCCACTAACGTATGGCGATAGCCCAGACGACGTAAGACTTGGGTAACCATCGATTTTGCAAT
AATGGAACCTAACGCTGTCGGTGCCATCATACAGCCAGCAATAAACGCCTGATAACCAAATCCTACCTGTAACATCAATG
GNATAAGGAACGGTACACAGCCGGTCCCCAGACGGGTTGCAATATTGCCTACGATACCGATCGAGAAAGTNGCGGGNTTT
AAATAATCTAATGAAATTNATGGGTTGGCGTGCGTCGTGCATGAGAANNATANAAGNAGCAGTANNNATGCTGGNGANAN
TACCGTCNNGNANTCNNNCTGNGANANCTTTTNCCCNANAGNTCTNNNNNNTNGNNANAGAANNNNNNTGNNGNNANNNG
CAAAANNCNGNGNNNNCNNNNNNNGNNNNNNNGNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNCNNNANNCNNNTGGNNNN

>26_3.seq
NNNNNNNNNNNACCCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTANGTGGATC
CCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTGTCGTGACGTGATCCGCAAAAACAATCTCACCAGCGCCTATATCCGTCC
GCTGATCTTCGTCGGTGATGTTGGCATGGGAGTAAACCCGCCAGCGGGATACTCAACCGACGTGATTATCGCTGCTTTCC
CGTGGGGAGCGTATCTGGGCGCAGAAGCGCTGGAGCAGGGGATCGATGCGATGGTTTCCTCCTGGAACCGCGCAGCACCA
AACACCATCCCGACGGCGGCAAAAGCCGGTGGTAACTACCTCTCTTCCCTGCTGGTGGGTAGCGAAGCGCGCCGCCACGG
TTATCAGGAAGGTATCGCGCTGGATGTGAACGGTTATATCTCTGAAGGCGCAGGCGAAAACCTGTTTGAAGTGAAAGATG
GTGTGCTGTTCACCCCACCGTTCACCTCCTCCGCGCTGCCGGGTATTACCCGTGATGCCATCATCAAACTGGCGAAAGAG
CTGGGAATTGAAGTACGTGAGCAGGTGCTGTCGCGCGAATCCCTGTACCTGGCGGATGAAGTGNTTATGTCCGGTACGGC
GGCAGAAATCACGCCAGTGCGCAGCGTAGACGGTATTCAGGTTGGCGAAGGCCGTTGTNGNCCGGTTACCAAACGCATTC
AGCAAGCTTCTTCGGCTCTTCACTGGCGAAANNANNANNATGGGGCTGGTTAGATCAGTTATCANAAATACAAAAAATGG
NNGGNNNNGCACCGTCCCATTACGAGANNNANNNNTGGNNAGNAATAAGNNTGCTANNACCGTNCCGCCNCCNNCCNNNN
NNNGNCGTANNTGGNNNNGNTNNNGNNNCTNNNGNNNNNCCNCNNNGACCGANNCCGATTTCNGNANCCGANNNNNCNNG
NNNNNANNNNGNTCNCCNNTTGNNCNGGNNNNNNCNATNNGNNNNGANNNCNGNAANNGNNNCNNANATNNNNNNNNGNN
NNNNNNNNNNNNNNANNCNTNNNNNGGNNNNGNNNTGNCNNGNNNNNGNNAGNNTTNTNNNNNNNNNNNNNNNNNANNNN
NNGGNNNNNNN

>26_5.seq
NNNNNNNNNNACCCTCACTAAAGGGANCAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTNGTGGATCCCC
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTCTTTCATTCGCTGAAAGTGGAATGTATCCATGGAGAACACTTTATCAGCCGG
GAAATAATGCGGGCAACGGTGTTTAATTATATCGAATGTGATTACAATCGGTGGCGGCGGCACAGTTGGTGTGGCGGCCT
CAGTCCGGAACAATTTGAAAACAAGAACCTCGCTTAGGCCTGTGTCCATATTACGTGGGTAGGATCAGTCATCCCTTCGT
GGATCATTTTGACTGCCGCCTGCGCTATTCTGTTTTTTGGCGCGCTGGCGAGCTGAAATCGCTCTTTAAACCCGACTTCC
TGGGTCTCGGTTTCACTATTACCAGACATTATTTTCGCCGCACCGCCATGAAAGCGCGTAACCACGCCTTTTTGTTCGAG
AAAGCGCAAATCGGCACGGATTGTCGCTTCCGAGGCAGCAAATACTCCCGCCAGATCCTGAACAAGCACGGTTCCCTGTT
CATTCACTAATTGGATGATCTTATTCCTTCGCTCGAATGAATTCATCGTCATTTACCCATATTCAATTGTGGCTAGTGTA
AACGAAGGGGGACCATTGGTGAATGATCTGTTTTGCACAATACCGGGCCAGCATCACGCTGGCCCGCGGTTTCAGGGAAT
GAGCAACACTTTGCCCGGCATAGCATTACGAGCGATGTCACGCACCGCCTGGGCGAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCG
AGGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGAC
TGGGAAAACCCTGGNGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCNNCAGCTGGCGTANTAGCGAANAANG
NCCNCACCGATCGNCCNNNNNNNNTNGCGCANCCTGNATGNNGAATGNNNGCNNCCNNNNAGNNNNCNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNACNNNCAGCNNNACNGNTNACNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNTNCNNNNNNNNTTTNTN

>29.seq
GGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTTGCACATCGTCCATATTTCTGGCCTGGTG
GTTATTAATTTCAATGGCTGCCCATGTATTTGCACTTAGCAAAAGCACAGCCAGAAGGGCTAAAACACGACTGAACATAG
ATACCTCCTCGACGGCTGACTTTGTGTGCTCTCCTCTGTGATGATCTTCTGATTTAATTTTAATCAATGATAAAGAAGTT
GATGGTGACCATTTCTGATGCAGTTGTTCAAAAAAACACCATGATGAAGTGTGATGAACTTCAAATCAGCGTGTTAGAGG
TTAATTGCGAAAGGGGAGATTTATTTCGGCTCTGCCCTTGAGTTTAGCGAGGCATACAAGTACTATAACGCGTCATTTTT
CAGCCGACCTTTAACACGTTCCCTTGCCTCCCCCGGGAATTCCGGCTGACCCCAGAACAGGAGGGCCGAAATAAATCCGT
AAAGGAGCCAAATCGGATGGCCGTCATTACNGAANCCGTTTTAAGGGCCCAACCNGGACCAGANGNGANN